Importância do pré-tratamento da amostra
O pré-tratamento da amostra é uma etapa demorada e sujeita a erros na análise instrumental (especialmente na análise cromatográfica). A qualidade do tratamento da amostra afeta diretamente o resultado final da análise cromatográfica. Portanto, a fim de melhorar a eficiência da análise e determinação, melhorar e otimizar os métodos e técnicas de preparação de amostras para análise cromatográfica é uma questão importante. Como algumas amostras pertencem a sistemas de matriz complexos, contendo componentes como proteínas, óleos, carboidratos, pigmentos, etc., o fundo de matriz complexo causará grandes problemas à extração, separação, purificação e determinação dos compostos alvo a serem analisados. Portanto, o pré-tratamento da amostra não é apenas complexo e difícil, mas também tem um papel decisivo na precisão, confiabilidade e sensibilidade dos resultados da análise.
Porcentagem de consumo de tempo de pré-tratamento da amostra
Para instrumentos LC/MS/MS altamente sensíveis, o pré-tratamento adequado da amostra é crucial para reduzir a interferência da matriz e enriquecer os componentes.
Princípios de pré-tratamento de amostras
Evitar alterações químicas nos componentes durante o preparo; prevenir e evitar a contaminação de componentes pré-determinados; minimizar a introdução de compostos irrelevantes no processo de preparação; e torná-lo o mais simples e fácil possível.
Finalidade do pré-tratamento da amostra
Remover partículas; reduzir impurezas interferentes; concentrar vestígios de componentes; melhorar a sensibilidade e seletividade de detecção; melhorar o efeito de separação; proteger colunas e instrumentos cromatográficos; substituição de solvente.
Tendência de desenvolvimento de pré-tratamento de amostras
▶O pré-tratamento comum da amostra inclui: Método de digestão: um método de colocar a amostra com ácido, oxidante, catalisador, etc. em um dispositivo de refluxo ou dispositivo fechado, aquecendo, decompondo e destruindo a matéria orgânica. Método de digestão úmida
1. Método de digestão com ácido nítrico (para amostras de soluções aquosas mais claras) 2. Método de digestão com ácido nítrico-ácido perclórico (digestão de amostras contendo matéria orgânica difícil de oxidar) 3. Método de digestão com ácido nítrico-ácido sulfúrico (ácido nítrico: ácido sulfúrico=5:2, muitas vezes adicionando uma pequena quantidade de peróxido de hidrogênio) 4. Método de digestão com ácido sulfúrico-ácido fosfórico (ajuda a eliminar a interferência de íons Fe3+ durante a determinação) 5. Método de digestão com ácido sulfúrico-permanganato de potássio (comumente usado para determinar amostras de solução aquosa de mercúrio) 6. Método de digestão com ácido nítrico-peróxido de hidrogênio: Algumas pessoas usam este método para digerir produtos biológicos para determinar nitrogênio, fósforo, potássio, boro, arsênico , flúor e outros elementos 7. Método de digestão multicomponente: É necessário um sistema de digestão com três ou mais ácidos ou oxidantes. Método de cinza seca (método de decomposição em alta temperatura)
1. O método de cinzas não usa ou usa uma pequena quantidade de reagentes químicos para decompor amostras e pode lidar com amostras de pesagem maiores, por isso é benéfico melhorar a precisão da determinação de oligoelementos. 2. A temperatura de incineração é geralmente de 450-550 graus, o que não é adequado para processar amostras com componentes voláteis, e o tempo de incineração também é relativamente longo. 3. De acordo com o tipo de amostra e as propriedades dos componentes a serem medidos, são selecionados diferentes cadinhos e temperaturas de incineração. Os cadinhos comumente usados são quartzo, platina, prata, níquel, ferro, porcelana, politetrafluoroetileno e outras propriedades. O princípio é que o cadinho não reage com a amostra e é estável à temperatura de processamento. 4. Normalmente, nenhum outro reagente é adicionado às amostras biológicas de incineração, mas para promover a decomposição e inibir a perda por volatilização de certos elementos, uma quantidade apropriada de agente de incineração auxiliar é frequentemente adicionada. Após a amostra estar completamente incinerada, ela é dissolvida em ácido nítrico diluído ou ácido clorídrico para análise e determinação.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm) é maior que o do HLPC (3-10μm). Portanto, o SPE só pode ser usado para separar compostos com propriedades de retenção muito diferentes. A tecnologia SPE com baixa eficiência de separação é usada principalmente para processar amostras. O objetivo do SPE é remover da amostra substâncias que interferem nas análises posteriores; enriquecer os componentes do traço e melhorar a sensibilidade analítica; alterar o solvente da amostra para corresponder ao método analítico; derivatização in situ; dessalinização de amostras; e facilitar o armazenamento e transporte de amostras. Coluna SPE de instalação: O tamanho da partícula do enchimento é diferente do enchimento da coluna HLPC e o resto é o mesmo. A mais utilizada é a fase C18. Este tipo de carga é altamente hidrofóbica e apresenta retenção da maior parte da matéria orgânica na fase aquosa; outros materiais com diferentes propriedades de seletividade e retenção também são utilizados. Fases SPE com grupos ativos ou revestidas com compostos ativos podem ser utilizadas para analisar reações de derivatização. Disco SPE: muito semelhante aos filtros de membrana. O disco extrator é um disco de PTFE contendo carga ou uma folha de fibra de vidro carregada com carga; o enchimento representa cerca de 60% a 90% do disco SPE total e a espessura do disco é de cerca de 1 mm. A diferença do primeiro é a relação espessura/diâmetro do leito (L/d). Adequado para enriquecer vestígios de poluentes da água. Microextração em Fase Sólida (SPME) Offline e Online SPE Offline SPE 1. A SPE e a análise são realizadas de forma independente, e a SPE fornece apenas amostras adequadas para análise posterior. 2. Para garantir contato suficiente entre a solução da amostra e o enchimento, o fluxo de solvente não pode ser muito alto. 3. Pode ser completado por instrumentos automatizados. O instrumento SPE automático consiste em um suporte de coluna, uma bomba de êmbolo, um reservatório de líquido, uma tubulação e um processador de amostras. O SPE online também é conhecido como tecnologia de purificação e enriquecimento online, que é usada principalmente para o estabelecimento do método SPE de análise HLPC Finalidade do pré-tratamento da coluna: 1. Remover impurezas que possam existir no enchimento; 2. Solventize o enchimento e melhore a reprodutibilidade da extração em fase sólida Adição de amostra 1. Para evitar a perda de analitos, a concentração de solvente da amostra não deve ser muito alta; 2. Na extração com mecânica de fase reversa, utiliza-se água ou tampão como solvente, e a quantidade de solvente orgânico não ultrapassa 10% (V/V); 3. Para superar a perda de analitos durante a adição da amostra, solventes fracos podem ser usados para diluir a amostra, reduzir o volume da amostra, aumentar a quantidade de enchimento na coluna SPE e selecionar adsorventes que tenham forte retenção do analito. Eluição e coleta de analitos (outro caso é que as impurezas são retidas enquanto os analitos passam pela coluna) (Extração em fase sólida com meio de dispersão sólido) 1. Para colunas de extração em fase reversa, o solvente de limpeza é água ou tampão contendo uma concentração apropriada de matéria orgânica solvente; 2. Para determinar a concentração e o volume ideais do solvente de limpeza, adicione a amostra à coluna SPE, limpe-a com 5 a 10 vezes o volume do leito da coluna SPE, colete e analise o efluente por sua vez e obtenha o perfil de eluição do solvente de limpeza para o analito. Aumentar a concentração do solvente de limpeza, por sua vez, e determinar a concentração e o volume apropriados do solvente de limpeza de acordo com o perfil de eluição do analito em diferentes concentrações; 3. Objetivo da eluição e coleta: eluir completamente o analito e coletá-lo na menor fração volumétrica, retendo o máximo possível de impurezas que ficam mais fortemente retidas que o analito na coluna SPE; 4. Para aumentar a concentração do analito ou ajustar as propriedades do solvente para análise posterior, a fração do analito coletada pode ser seca com nitrogênio e depois dissolvida em um pequeno volume de solvente. Aplicação da Análise Ambiental SPE 1. A concentração de analitos em amostras ambientais, como águas superficiais, é muito baixa e o analito deve ser enriquecido antes da análise. 2. A composição dos fluidos biológicos é complexa e contém grande quantidade de proteínas. Antes da análise, a amostra precisa ser pré-tratada para remover a proteína. Análise de medicamentos Análise clínica Análise de alimentos e bebidas Microextração em fase sólida (SPME) A microextração em fase sólida integra "amostragem, extração, concentração e injeção" e pode ser usada em conjunto com cromatografia gasosa ou cromatografia líquida de alto desempenho para tecnologia de pré-tratamento de amostras. Teoria da microextração em fase sólida Teoria do equilíbrio: Durante o processo de adsorção, um equilíbrio de adsorção é estabelecido entre a fase sólida e líquida ou gasosa. Dentro de um certo período de tempo, devido ao lento processo de transferência de massa, o equilíbrio não é totalmente alcançado. A seletividade da extração do material de revestimento depende principalmente do desempenho do material de revestimento. De acordo com o princípio de que o analito é facilmente extraído por uma fase sólida com polaridade semelhante, um revestimento SPE adequado é selecionado. As substâncias mais comumente utilizadas para revestimentos de fase sólida são o polimetilsiloxano (PDMS) e o poliacrilato (PA), ambos os quais podem ser utilizados para cromatografia gasosa e cromatografia líquida. O primeiro é usado principalmente para compostos não polares, como compostos voláteis, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e hidrocarbonetos aromáticos, e o último é usado principalmente para compostos polares, como triazinas e compostos fenólicos. A camada de fase sólida pode ser revestida na fibra de quartzo numa forma não ligada, ligada ou parcialmente reticulada. Adicionar alguns polímeros ao revestimento pode aumentar a área superficial do revestimento e melhorar a eficiência do SPME. 1. Polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PDMS-DVB), utilizado para hidrocarbonetos aromáticos e compostos voláteis. 2. Polietilenoglicol-divinilbenzeno (CW-DVB), usado para compostos polares como álcoois. 3. Resina modelo de polietilenoglicol (CW-TPR), usada para surfactantes ionizados. 4. Fibra de quartzo revestida com negro de fumo de grafite, usada para analisar vestígios de poluentes na água e no ar. 5. Estabelecimento de métodos de nanotubos de carbono e nanotubos de dióxido de titânio 1. Manter a consistência das condições de amostragem. 2. Os factores que afectam a amostragem incluem o tempo de amostragem, a temperatura, a profundidade da fibra, etc. 3. Manter uma relação linear entre o valor de resposta e a concentração inicial do analito. A concentração da amostra não pode ser muito alta e o volume da amostra não pode ser muito pequeno, de modo que a extração fique dentro da faixa linear da isoterma de adsorção. 4. Adicionar eletrólitos à amostra pode aumentar a força iônica da solução, reduzindo assim a solubilidade do analito e melhorando a eficiência da extração; alterar o pH da amostra tem um efeito maior na taxa de extração de substâncias ácidas e alcalinas. Nota: O efeito da adição de sal na microextração às vezes é diferente daquele da extração líquido-líquido convencional, e as condições experimentais precisam ser otimizadas. 5. A agitação pode reduzir o tempo de extração. Extração por microondas (MAE) A extração por microondas tem tempo de extração curto, boa seletividade, alta taxa de recuperação, baixo uso de reagentes, baixa poluição, pode usar água como extrator e pode controlar automaticamente as condições de preparação da amostra; tem menos aplicações e atualmente é utilizado na extração de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, resíduos de pesticidas, compostos organometálicos, princípios ativos em plantas, substâncias nocivas, metais em minerais, medicamentos no sangue e resíduos de pesticidas em amostras biológicas. Princípios e características dos métodos de extração por micro-ondas Absorver micro-ondas (água, etanol, ácidos, álcalis e sais) Alta eficiência de extração por micro-ondas: 1. Ação direta das micro-ondas sobre as substâncias separadas; 2. É mais vantajoso usar solventes polares do que solventes não polares para extração por microondas; 3. A utilização de recipientes fechados permite que a extração por micro-ondas seja realizada a uma temperatura muito superior ao ponto de ebulição do solvente, melhorando significativamente a eficiência da extração por micro-ondas Refletir micro-ondas (substâncias metálicas) Transmitir micro-ondas (substâncias não polares) Extração por micro-ondas equipamentos e métodos (os principais componentes são dispositivos de aquecimento por micro-ondas especialmente fabricados, recipientes de extração e dispositivos de controle de pressão e temperatura equipados de acordo com diferentes requisitos) Multicavidade 2450 MHz: Várias amostras podem ser preparadas ao mesmo tempo, é fácil controlar as condições de extração , e o a extração é rápida. Método convencional de extração por micro-ondas: Misture solventes polares ou uma mistura de solventes polares e solventes apolares com as amostras extraídas, coloque-as em recipientes de preparação de amostras de micro-ondas e aqueça-as em um sistema de preparação de amostras de micro-ondas em estado fechado. Controlar a pressão ou temperatura e tempo de extração de acordo com os requisitos dos componentes extraídos; no final do aquecimento, filtre a amostra e o filtrado é medido diretamente ou medido após o tratamento correspondente. Em circunstâncias normais, o tempo de aquecimento da extração por microondas é de cerca de 5 a 10 minutos. O volume total do solvente de extração e da amostra não deve exceder 1/3 do volume do copo de preparação da amostra. Focagem de modo único 2450 MHz: Não é necessário controle de pressão e temperatura, o volume de preparação da amostra é grande, apenas uma amostra pode ser preparada por vez e o tempo de extração é longo. Extração de fluido supercrítico (SCF)
Fluido supercrítico (SCF) é um fluido cuja temperatura e pressão são superiores ao ponto crítico. Suas características próprias são: 1. Seu coeficiente de difusão é menor que o do gás, mas uma ordem de grandeza superior ao do líquido; 2. Sua viscosidade é próxima à do gás; 3. Sua densidade é semelhante à do líquido, e uma ligeira mudança na pressão pode levar a uma mudança significativa em sua densidade; 4. Mudanças na pressão ou temperatura podem levar a mudanças de fase. Princípio básico No estado supercrítico, o fluido supercrítico entra em contato com a substância a ser separada, de modo que possa extrair seletivamente os componentes de polaridade, ponto de ebulição e massa molecular relativa, por sua vez, e a densidade e constante dielétrica do fluido supercrítico aumentam com o aumento da pressão do sistema fechado, e a polaridade aumenta. Os componentes de diferentes polaridades podem ser extraídos passo a passo usando o programa boost. A solubilidade do CO2 supercrítico: 1. Componentes lipofílicos e de baixo ponto de ebulição podem ser extraídos a baixa pressão (104kPa); 2. Quanto mais grupos polares um composto tiver, mais difícil será sua extração; 3. Quanto maior a massa molecular relativa do composto, mais difícil será sua extração. O modificador CO2 é um solvente apolar e geralmente um solvente polar é adicionado para melhorar sua solubilidade em CO2, por isso é chamado de modificador. Os mais utilizados são metanol, acetona, etanol, acetato de etila, etc. O efeito do modificador é limitado. Ao alterar a solubilidade do fluido supercrítico, também enfraquecerá o efeito de captura do sistema de extração, resultando em aumento de coextratos, o que pode interferir na determinação analítica. A quantidade de modificador utilizada deve ser pequena, geralmente não excedendo 5%. A aplicação da tecnologia de extração com fluido supercrítico apresenta grandes vantagens na extração de substâncias naturais; pode ser usado em conjunto com GC, IR, MS, LC, etc. para se tornar um método analítico eficiente.
